2011: Современные возможности роботизированной микроскопии

2011: Современные возможности  роботизированной микроскопии

В.С.Медовый

доктор технических наук,

директор ЗАО «Медицинские компьютерные системы (МЕКОС)», Москва

medovy@mecos.ru , +7(495)9153846

Аннотация

При применении роботизированных комплексов микроскопии (РКМ) рекомендации руководств по методикам анализа могут быть реализованы в полном объеме, что позволяет внедрить стандарт качества с более высокой чувствительностью метода по сравнению с ручной микроскопией. Обсуждаются условия эффективного применения моделей РКМ с разным составом функций и разным уровнем автоматизации.

В настоящее время основной объем медицинских микроскопических анализов выполняется «вручную», то есть врач-лаборант сам выполняет операции управления микроскопом, поиска и классификации объектов анализа. В прошедшем десятилетии на рынке появились комплексы роботизированной (автоматизированной) микроскопии (РКМ), частично или полностью заменяющие глаза и руки врача. Востребованность РКМ связана с высокой диагностической значимостью микроскопических анализов и с серьезными недостатками ручной микроскопии, не позволяющими в массовых масштабах обеспечить необходимую точность и полноту анализов.

Создание РКМ является сложной задачей из-за высокой изменчивости состава и большого объема микроскопических препаратов, разнообразия объектов анализа и фона, а также из-за природы  определения анализируемых объектов через визуальные качественные термины, не имеющие ясного количественного эквивалента. 

В состав современного РКМ может входить универсальное или специально разработанное оборудование: моторизованный микроскоп, загрузчик стекол, видеокамера, компьютер. Автоматизированные функции анализа реализованы в специальном программном обеспечении.

1.      Стандартизация качества за счет автоматизации специфических операций методики микроскопического анализа

В качестве примера данного подхода рассмотрим реализацию в РКМ автоматизированной методики анализов мазков крови.

1.1. Уровень выполнения анализов мазков крови при ручной микроскопии.

Приведем  краткую сводку рекомендаций по методике микроскопических анализов мазков крови по  данным известных руководств [1-6], которую можно рассматривать в качестве «ТЗ» на РКМ для данного вида анализа.

1) Многие болезни могут давать нормальные формульные соотношения клеток крови и ненормальную морфологию клеток, необходим по крайней мере выборочный микроскопический контроль результатов проточного гемоанализатора. Микроскопический анализ необходим, если проточный гемоанализатор указал на отклонение от нормы (флаги).

2) Исследование мазков крови включает полную лейкоцитарную формулу, обнаружение необычных клеток, необычной морфологии эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов.

3) Ручной анализ мазков крови является трудоемкой и ответственной работой, требующей высокого напряжения. Нагрузка на персонал, качество рабочих мест должны быть на приемлемом уровне.

4) Анализ мазков крови должен делать только специально обученный высококвалифицированный персонал. Рекомендуется внешняя оценка квалификации персонала, включая оценку качества пробоподготовки, качества выполнения визуального анализа и качество документации с результатами анализа. Рекомендуется применение телемедицины  с использованием изготовленных КАМ виртуальных мазков крови («виртуальных слайдов»).

5) Для обнаружения атипичных и юных форм необходимо просматривать весь мазок на малом увеличении с переходом на большое увеличение при их обнаружении для идентификации. Для детального исследования морфологии нужно применять объектив 100х ми.

6) При приготовлении мазков с помощью шпателя лейкоциты стремятся  сосредоточиться в «щетке» и на краях мазка в большей степени, чем в центре. Более крупные клетки (бласты, моноциты) в большей степени стремятся к краям мазка. Применение покровных стекол и центрифугирование уменьшают эти тенденции.

7) При анализе лейкоцитов основными источниками ошибок являются: неравномерное распределение лейкоцитов в мазке; ошибки распознавания лейкоцитов; статистическая ошибка размера выборки. Плохое приготовление и окраска мазка являются основными причинами ошибок распознавания и распределения клеток в мазке.

8) Выполнять скрининг нужно начиная с области, где около 50% эритроцитов перекрываются, перемещаясь к области, где эритроциты имеют ориентацию (в щетке). Указанная рабочая зона должна иметь минимум 2.5 см в длину и заканчиваться минимум за 1 см от конца стекла. В ней должно содержаться не менее 300 лейкоцитов. При лейкопении нужно использовать несколько мазков. Для обычных мазков при подсчете лейкоцитарной формулы рекомендуется  зубчатая траектория сканирования со сменой направлений после просмотра равных количеств полей зрения.

9). При размере выборки в 100 клеток статистическая ошибка при подсчете лейкоформулы сравнима с диапазоном нормы. Рекомендуется размер выборки лейкоцитов от 200 клеток.

Полное выполнение всех 9 перечисленных выше рекомендаций в массовых масштабах при ручной микроскопии  неосуществимо из-за общеизвестных недостатков: трудоемкость, нехватка квалифицированного персонала, субъективность, плохая эргономика, слабый контроль качества, отсутствие информационных услуг и др. Это и определяет характер указанных условий как рекомендаций, а не как требований стандарта качества. В руководствах по лабораторной гематологии предлагаются компромиссные рутинные варианты анализа, снижающие вероятность правильного диагноза, но увеличивающие объем производства: использование выборки в 100 лейкоцитов; анализ только на большом увеличении с поиском атипичных клеток не во всем мазке, а только на краях рабочей зоны; использование объектива 50х ми. В любом случае визуальная оценка морфологии собранной выборки клеток является главным элементом анализа.

1.2.                       От рекомендаций к стандарту качества микроскопии мазков крови

РКМ автоматизирует процесс сбора выборки и сортировки клеток мазка крови, заменяя в этом процессе глаза и руки врача. Возможности современных РКМ на разных этапах этого процесса различны. Сбор выборки, связанный с навигацией, перемещением препарата, фокусировкой, сменой объективов, обнаружением и сбором выборки эритроцитов, тромбоцитов и ядросодержащих клеток, контролем качества мазка (рекомендации 5, 7, 9) выполняется с качеством, в среднем значительно превосходящим ручную микроскопию [7,8]. С помощью РКМ легко продемонстрировать неустранимые ошибки компромиссных вариантов  анализа, таких как подсчет формулы лейкоцитов на базе 100 клеток. В то же время качество оценки атипичной морфологии, сортировки юных и патологических форм клеток в собранной выборке по типам в современных РКМ значительно уступают возможностям зрительного анализатора опытного врача-лаборанта.  Поэтому РКМ работают в режиме «поддержки» визуального анализа. Избавляя врача от изнурительной микроскопии и обеспечивая комфортабельное рабочее место перед экраном компьютера, РКМ сортирует автоматически собранную выборку клеток по нормальным типам и по небольшому числу других типов.  Изображения клеток в форме галерей по типам клеток предъявляются врачу для визуального просмотра на экране компьютера. Атипичные клетки при этом могут оказаться в галереях нормальных типов или в общей галерее «необычные клетки». Просматривая галереи, врач может несколькими нажатиями клавиш исправить ошибки автоматической сортировки и выполнить дополнительную сортировку. Указанный компьютерный визуальный анализ выборки в 200 клеток обычно занимает до 30 секунд. Уточненные врачом галереи сортировки вместе с оценками атипичной морфологии фиксируются в базе данных и могут быть использованы для ретроспективного анализа, контроля качества и обучения персонала. Таким образом, РКМ выполняет все рекомендации по самому процессу микроскопии (2,3,5,8,9) и выполняет контроль качества выполнения остальных не зависящих от РКМ рекомендаций (к пробоподготовке и визуальному анализу, требования 1,4,6,7). Кроме того, РКМ способен изготавливать цифровые копии препаратов («виртуальные слайды»), которые наряду с галереями можно использовать для телемедицинских консультаций и обучения персонала [9]. Важным свойством РКМ МЕКОС-Ц2 является возможность полного контроля качества автоматических операций потребителем с применением специализированных «референсных» виртуальных слайдов [10]. Выполнение анализов в полном соответствии со всеми рекомендациями 1-9 при этом переходит из разряда углубленных в разряд рутинных, повышая среднюю диагностическую значимость. Указанные рекомендации при этом становятся требованиями стандарта качества, применимого в рутинной практике обычной лаборатории.

1.3.                       Условия эффективного использования РКМ различных моделей для анализов мазков крови

В таблице 1 представлены некоторые современные модели РКАМ производства фирм МЕКОС (Россия) и Cellavision (Швеция) [11,12] и их возможности осуществлять пункты требований 1-9. Как видно из таблицы, старшие модели обеспечивают весь набор требований, недорогие младшие модели обеспечивают неполный набор. Разные модели имеют разную производительность.

В современных клинических лабораториях часто применяется схема, при которой микроскопический анализ мазков крови выполняется только в случаях, когда проточный гемоанализатор показал необходимость выполнения такого анализа. При обследовании населения в среднем такие случаи составляют до 10-15% от общего потока анализов [1]. В лабораториях, ориентированных на определенные контингенты больных, этот процент может быть значительно выше. В зависимости от контингента больных, оснащения лаборатории, имеющегося персонала могут использоваться разные схемы анализа, в том числе 100% микроскопический анализ клеток крови.

Пропускная способность современных РКМ при правильно выбранной комплектации не является лимитирующим фактором и их возможности улучшить качество анализов востребованы персоналом.

Таблица 1. Характеристики некоторых моделей РКМ производства МЕКОС (Россия) и Cellavision (Швеция).

В большинстве российских лабораторий до сих пор либо вообще не применяются, либо применяются проточные гемоанализаторы с ограниченным составом параметров, вычисляющие, в частности, лейкоцитарную формулу с разделением на 2-3 позиции. Мазки крови в таких лабораториях используются для всего потока заявок на общий клинический анализ главным образом для подсчета лейкоформулы.

В лабораториях с небольшим потоком анализов клеток крови (до 100) даже при 100% микроскопии нагрузка на младшие недорогие модели РКМ остается на приемлемом уровне. Однако в крупных слабо оснащенных лабораториях внедрение младшей модели РКМ может привести к неудовлетворительным результатам. Если мазков больше 100 на один комплекс, основным критерием работы РКМ с точки зрения обслуживающего персонала становится не качество анализов, а пропускная способность. Решая купить или не купить РКМ, руководителю лаборатории необходимо сделать выбор не столько между разными пропускными способностями лаборатории, сколько между разными уровнями качества и использования анализов, разными условиями труда, разными возможностями обучения персонала. Необходимо создать условия достаточной пропускной способности РКМ. Рекомендуется применять рассмотренную двухэтапную схему, ограничивающую поток микроскопических анализов. Целесообразно использовать информационные возможности, благодаря которым весьма простое обслуживание потока мазков крови на РКМ и просмотр галерей могут выполнять специалисты разной квалификации, в том числе дистанционно. 

Таким образом, РКМ позволяет на практике в массовых масштабах внедрить выполнение микроскопических анализов мазков крови в соответствии с полным набором требований, что неосуществимо без применения РКМ. Автоматизация компромиссных рутинных вариантов анализа также дает значительный эффект благодаря радикальному улучшению условий труда, контролю качества, телемедицине.

2.      Стандартизация за счет внедрения виртуальной микроскопии

Производство виртуального слайда (цифровой копии препарата) в настоящее время может выполняться за приемлемое время, если пробоподготовка обеспечивает достаточно компактное представление образца.  Рассмотрим реализацию соответствующей автоматизированной методики РКМ на примере паразитологического анализа препаратов фекалий.

Данный вид анализа в РКМ МЕКОС-Ц2 [12] выполняется с применением пробоподготовки, разработанной фирмой DiaSys [13].

На 1-м этапе выполняется центрифугирование образцов фекалий в специальных одноразовых фильтрующих пробирках (PARASEP), позволяющее стандартизовать общеизвестную методику эфир-формалинового осаждения. На 2-м этапе выполняется стандартизованный забор пробы из пробирки в специальную слайд-камеру (с помощью станции Fe-5), установленную на предметном столе микроскопа. При этом в одну из полостей камеры добавляется концентрат фекалий, а в другую полость добавляется смесь концентрата фекалий с йодом или с изотоническим раствором. Исчезает необходимость одноразовых пипеток, предметных и покровных стекол, концентрат фекалий находится в герметичной системе.

На 3-м этапе анализа РКМ МЕКОС-Ц2 сначала автоматически изготавливает цифровую копию препарата - стандартный 3-х мерный виртуальный слайд (ВС), сканируя слайд-камеру. Время формирования ВС составляет 2-3 минуты. ВС, записанный в базу данных или переданный по линиям связи, может использоваться для более быстрого и тщательного по сравнению с прямой микроскопией визуального анализа врачом на отдельном, в том числе удаленном, компьютере. Увеличение скорости и тщательности связано с автоматическим выбором для первичного просмотра наиболее контрастного фокусного слоя в каждом поле зрения ВС. В качестве поддержки визуального анализа МЕКОС-Ц2 выполняет автоматическое обнаружение яиц гельминтов в ВС, изображения которых в попадают в базу данных и в форме галерей на экране компьютера для визуальной идентификации врачом.

Аналогичная схема анализа может применяться для ряда других, прежде всего скоропортящихся препаратов, таких как осадок мочи, мокрота, фекалии на копрологию и др. В состав

РКМ МЕКОС-Ц2 могут быть включены универсальные информационные и измерительные функций, что позволяет использовать МЕКОС-Ц2 в качестве многофункциональной станции для выполнения широкой группы исследовательских анализов.

Сказанное позволяет рассчитывать на значительный рост рынка РКМ в ближайшие годы.

Литература

1.      Wintrobe’s Clinical Hematology 11^th Ed. Lippincot Williams&Wilkins Publisher, 11^th edition (December 2003).

2.      Vives Corrons JL, Albare`de S, Flandrin G, Heller S, Horvath K, Houwen B, et al. Guidelines for blood smear preparation and staining procedure for setting up an external quality assessment scheme for blood smear interpretation. Part I: control material. Clin Chem Lab Med 2004;42:922–6.

3.      Vives Corrons JL, Marjan Van Blerk, Stephanie Albare`de, et al. Guidelines for setting up an External Quality Assessment Scheme for blood smear interpretation. Part II: survey preparation, statistical evaluation and reporting. Clin Chem Lab Med 2006;44(8):1039–1043

4.      Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е., Долгов В.В. Лабораторная гематология. М. – Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2006

5.      Bain Barbara J. Diagnosis from the Blood Smear. NEJM, Volume 353:498-507 August 4, 2005 Number 5

6.      Abramson N. Inside blood: a picture (in the microscope) is worth a thousand words. Blood 2004;103:367-368

7.      Swolin B., Simonsson P. et al. Differential counting of blood leukocytes using automated microscopy and a decision support system based on artificial neural networks – evaluation of DiffMaster Octavia. Clin Lab Haematol. 2003 Jun; 25(3):139-147

8.      Плясунова С.А., Р.Ш. Балугян, К.Е. Хмельницкий, В.С. Медовый, А.А. Парпара, А.М. Пятницкий, Б.З. Соколинский, В.Л. Демьянов, Д.С. Николаенко. Автоматизированные методики микроскопических анализов мазков крови - медицинские испытания комплекса МЕКОС-Ц2. Клиническая лабораторная диагностика, N10, 2006, стр. 22-24, 33-39.

9.      Luethi U, Risch L, Korte W, Bader M, Huber R. Telehematology: critical determinants for successful implementation. Blood 2004;103: 486-488.

10.  Медовый В.C., Николаенко Д.С., Парпара А.А., Пятницкий А.М., Соколинский Б.З., Демьянов В.Л., Журкина Т.В., Пальчунова И.Б.. Автоматизация микроскопических анализов мазков крови и контроль качества с применением референсных виртуальных слайдов. Клиническая лабораторная диагностика, N6, 2008, стр. 46-50.

11.  Cellavision, www.cellavision.com

12.  МЕКОС, www.mecos.ru

13.  Diasys, www.diasys.com