В обзоре анализируются характеристики 2-х основных групп анализаторов морфологии биоматериалов - проточных систем и систем автоматической микроскопии. Несмотря на успехи проточных систем в анализе простой морфологии клеток крови и осадка мочи, современные системы автоматической микроскопии значительно укрепили свои позиции и могут потеснить проточные системы в ряде областей в ближайшем будущем.
(опубликовано 28.03.2014)
1
АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ МЕТОДИКИ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО АНАЛИЗА МОРФОЛОГИИ БИОМАТЕРИАЛОВ. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.
В.С.Медовый
ЗАО "Медицинские компьютерные системы (МЕКОС)", Москва
Медицинская автоматизированная микроскопия (МАМ) применяется в настоящее время главным образом для выполнения рутинных функций сбора выборок и относительно несложного анализа морфологии клеток, тканей, патологических объектов, для количественного анализа меток. Комплексы МАМ относятся к классу image анализаторов, автоматически выполняя сканирование препарата и анализируя морфологию объектов поля зрения микроскопа. МАМ формирует цифровую модель препарата, существенно меньшую по объему визуальных данных, чем исходный натуральный препарат. Задачей МАМ является создание модели, максимально сохраняющей диагностическую информацию и минимально недиагностическую. В настоящее время производители специализированных комплексов МАМ добились успехов в автоматизации многих медицинских анализов, таких как анализы мазков крови, осадка мочи, спермы, паразитологических объектов, онкологических меток и др. [1-6]. Комплекс МАМ, реализующий подобные методики, не является полностью автоматическим анализатором. Результаты автоматических функций МАМ в форме моделей препарата (сортированные галереи изображений объектов анализа, характерные поля зрения, 2D или 3D панорамы - виртуальные слайды) вместе с количественными оценками объектов анализа сохраняются в базе данных для контроля и возможной корректировки автоматических результатов и возможного дополнительного более тонкого визуального анализа морфологии врачом. Несмотря на более чем 50-летние усилия мирового сообщества, до последнего времени комплексы МАМ оставались дорогими (1-5 млн рублей в зависимости от уровня автоматизации загрузки препаратов) полуавтоматическими инструментами с чувствительностью на уровне более трудоемких традиционных ручных аналогов. Более широкое распространение получили системы информационной поддержки микроскопических анализов морфологии, создающие цифровую модель препарата, эквивалентную исходному натуральному препарату (виртуальные слайды) и (или) сохраняющие диалоговый доступ к оригиналу на всех этапах анализа [7,8]. Такие системы, не имеющие самостоятельных автоматических этапов собственно анализа, правильнее относить не к классу МАМ, а к классу медицинской информационной микроскопии (МИМ).
После 2012 г пропускная способность комплексов МАМ стала значительно превосходить пропускную способность врача, выполняющего прямой визуальный анализ в окулярах микроскопа. Трудозатраты врача при применении МАМ многократно снизились. Недорогие модели позволяют одновременно загружать небольшое число препаратов, модели с загрузкой до 200 препаратов обслуживают дневную партию автономно, сохраняя в базе данных компактные визуальные модели препаратов для последующего или параллельного просмотра врачом на экране компьютера.
Способны ли современные комплексы МАМ внести свой собственный уникальный вклад в диагностику заболеваний, как это сделали, например, автоматические гемоанализаторы, или роль МАМ останется вспомогательной, привязанной к квалификации врача и лишь улучшающей условия его работы? Рассмотрим некоторые факторы, позволяющие считать современную медицинскую автоматизированную микроскопию технологией, обеспечивающей новый уровень диагностики широкой группы заболеваний.
1. Возможность увеличения в несколько раз площади сканирования препарата, объема анализируемых выборок по сравнению с рутинной ручной микроскопией. Увеличение чувствительности традиционной методики до уровня, обеспечивающего ранее недоступное обнаружение патологических объектов при их низкой концентрации. Применение высокочувствительной методики МАМ, в частности, при массовых обследованиях населения с выявлением патологии на ранних стадиях развития.
Характерным современным примером является обнаружение и подсчет редко встречающихся атипичных и патологических форм клеток крови [9]. Автоматический гемоанализатор способен сообщить только о факте обнаружения редких клеток, не идентифицируя их, возможны также ложные тревоги [10]. Для того, чтобы увидеть эти клетки в мазке крови, как того требует инструкция по применению гемоанализатора, врачу нужно под микроскопом просмотреть выборку клеток с достаточно высокой вероятностью присутствия данной редкой формы. Например, если редкая клетка имеет относительную к остальным лейкоцитам концентрацию 1/500, то в мазке крови нужно просмотреть хотя бы 500 лейкоцитов. В реально достижимых в практике ручной микроскопии выборках объема в 100-200 лейкоцитов вероятность обнаружения форм при их низкой концентрации невелика. Поэтому, как правило, не обнаруживая под микроскопом редкие формы, врач ставит (в соответствии с рекомендациями производителя гемоанализатора) порог чувствительности гемоанализатора достаточно большим (4-5% выборки), чтобы "ложные" флаги не заставляли выполнять бесполезную работу! То есть из-за принципиальных ограничений технологии анализа, выполняемого парой гемоанализатор - врач блокируется весьма важная часть анализа клеток с концентрацией до 4-5%, способная дать незаменимую диагностическую информацию. Отметим, что в части редких форм автоматический гемоанализатор из-за необходимости дополнительной микроскопии такой же полуавтоматический инструмент, как и МАМ. Современные системы МАМ делают реальным в рутинной практике анализ выборки в 300-1000 лейкоцитов, увеличивая чувствительность к редким формам до 1% и менее. Применение триады гемоанализатор - комплекс МАМ - врач реализует новую высокочувствительную методику, технологически пригодную для применения при массовых обследованиях и создающую новую диагностическую информацию. Высокопроизводительные интегрированные системы гемоанализатор - комплекс МАМ для крупных лабораторий в настоящее время поставляются несколькими ведущими производителями гемоанализаторов [11,12]. Более экономные решения [6] с автономным этапом изготовления мазков позволяют интегрировать МАМ с большинством гемоанализаторов.
Информационные технологии комплексов класса МИМ также могут не только улучшить эргономику рабочего места врача но и повысить чувствительность традиционной методики. Например, из-за ограничений ручной микроскопии яйца гельминтов и простейшие при их низкой концентрации в препаратах в большинстве случаев не могут быть обнаружены при массовых обследованиях. Комплекс МЕКОС-Ц2 в режиме МИМ создает виртуальный слайд - цифровой аналог препарата и выполняет автоматическое обнаружение яиц гельминтов с формированием галереи объектов анализа. Эта галерея формирует "второе мнение", существенно увеличивая вероятность обнаружения при низких концентрациях. Визуальный анализ простейших в виртуальном слайде имеет ряд информационных преимуществ перед прямой микроскопией, также увеличивая чувствительность методики [6].
2. Формирование в МАМ цифровых моделей препаратов позволяет использовать современные информационные технологии, объединить и оптимизировать усилия врачей в масштабах региона и страны в целом. Благодаря телемедицинской составляющей системы МАМ совместно с Интернет ресурсами телемедицины создают новый уровень обслуживания микроскопических анализов, обучения и контроля качества работы персонала.
Телемедицинские консультации формируемых МАМ цифровых моделей препаратов в большинстве случаев не требуют применения дорогих линий связи с высокой пропускной способностью. Объем моделей МАМ препаратов крови, мочи, спермы, фекалий в среднем меньше 10-20 Мб, что позволяет воспользоваться дешевым почтовым ресурсом Интернет. Конфиденциальность может быть обеспечена применением кодирования и исключением передачи персональных данных. Если удастся организовать дистанционное выполнение диалоговой части анализа, контролирующей и корректирующей результаты автоматических функций МАМ, это создаст новый уровень качества анализов и кооперации врачей-лаборантов. В частности, это стимулировало бы лаборатории применять стандартизованную высококачественную пробоподготовку, постоянный жесткий контроль которой осуществляется одновременно с консультацией. Такой контроль без МАМ практически неосуществим. Подобная телемедицинская система могла бы быть реализована сначала в рамках крупных сетевых лабораторных учреждений, таких как Инвитро. При низкой стоимости пересылки моделей препаратов значительный экономический эффект может быть получен за счет рационального перераспределения нагрузки врачей, находящихся в разных регионах и просматривающих с помощью Интернета выходные галереи объектов анализа удаленных комплексов МАМ.
Указанный проект лабораторной телемедицины [17] дешев, прост в реализации, но, несмотря на казалось бы очевидные преимущества, остается невостребованным нашим медицинским сообществом. В настоящее время в России информационная дистанционная поддержка лабораторных микроскопических анализов находится в зачаточном виде и ограничивается внешним контролем качества ФСВОК с помощью рассылаемых на DVD моделей препаратов в форме виртуальных слайдов биоматериалов, произведенных с помощью комплексов МИМ [14].
3. Телемедицинский ресурс наполнения базы данных разработки и испытаний МАМ
Рассмотрим классификацию комплексов МАМ как изделий медицинского назначения и требования к методикам их медицинских испытаний. Комплекс МАМ в штатном режиме анализа биоматериала выполняет неконтролируемые врачом автоматические функции, медицинские испытания МАМ должны включать в себя сравнение результатов анализа средствами МАМ и результатов анализа однотипного биоматериала с применением аналогичной контролируемой референсной методики. В качестве последней общеизвестный стандарт испытаний [13] рекомендует использовать независимую ручную микроскопию опытными врачами. Методика испытаний [13] трудоемка, дорога, и по этим причинам может применяться только на ограниченном количестве препаратов, не полностью покрывающем многообразие патологий и вариантов пробоподготовки. При проведении испытаний указанного типа комплексов МАМ Cellavision и МЕКОС-Ц2 использовались выборки мазков крови нескольких сотен пациентов [1,3]. Проведение подобных испытаний является обязательным элементом аттестации комплекса МАМ для применения в медицинской практике. Вместе с тем весьма актуальной остается задача полномасштабных испытаний МАМ на всем многообразии медицинского биоматериала. Очевидно, что методика таких испытаний не может быть основана на сравнении с ручной микроскопией. В [15] рассмотрена методика дополнительных испытаний МАМ в процессе эксплуатации, основанная на рассмотренном выше механизме телемедицинских консультаций моделей препаратов. При этом в качестве референсной методики используется контроль врачом модели препарата, соответствующей траектории сканирования на микро и макроуровнях. Такая модель позволяет оценить качество автоматических функции МАМ в части сканирования и сбора выборки. Сама эта проверка является нетрудоемкой штатной процедурой периодического технического контроля комплекса МАМ и рекомендуется для 0,1% анализируемых препаратов. При появлении редких или необычных объектов и патологий врач может использовать эту процедуру для пополнения базы испытаний МАМ. В случае анализа мазков крови объем модели указанного типа порядка 100 Мб, что вполне приемлемо для пересылки по обычным дешевым линиям связи. Это позволяет получать результаты тестирования параллельно из многих лабораторий. Для тестирования автоматической сортировки достаточно пересылать в базу испытаний галереи изображений объектов выборки с объемом до 20 Мб. Такая же основанная на кооперации врачей и разработчиков технология служит для пополнения базы разработки новых версий МАМ, устраняющих выявленные в процессе испытаний недостатки. Поскольку новые версии МАМ связаны главным образом с модификацией алгоритмов программного обеспечения, внедрение новых версий может осуществляться по известным механизмам обновления через Интернет. Рассмотренная технология разработки и испытаний с использованием полномасштабной базы данных реализуема только в классе МАМ. Испытания МАМ в соответствии с [13] или [15] устанавливают, что врач может работать с полученной с помощью МАМ моделью препарата значительно меньшего объема, чем натуральный препарат, без ущерба для качества анализа. Если такие испытания не проведены, при применении МАМ могут быть получены вводящие в заблуждение результаты. В связи с этим лаборатории, эксплуатирующие комплексы МАМ, не прошедшие соответствующие классу данного анализатора испытания, берут на себя весьма обременительную ответственность контроля представительности найденной выборки клеток по отношению к исследуемому препарату при выполнении каждого анализа. Очевидно, что такие устройства не могут использоваться в медицинских целях.
Системы класса МИМ, не претендующие на автономные автоматические функции анализа и работающие с сохранением всей информации натурального препарата, могут использоваться без проведения испытаний по методикам типа [13,15].
4. Представительность базы данных методики анализа. Применение количественной денсито- и морфометрии для идентификации типов объектов анализа и диагностики, создание автоматического МАМ анализатора.
Цифровая микроскопия способствовала появлению в 80-2000-х годах огромного количества работ по применению денситометрии и морфометрии клеток и тканей. В целом результаты этих работ для практической медицинской диагностики оказались меньшими, чем ожидалось. Основными причинами этого являются трудности автоматического определения сложных границ клеток и тканей, выбора критериев количественной оценки их внутренней структуры, недостаточно представительные выборки измеряемых объектов. Малые объемы коллекций препаратов и выборок анализируемых объектов в препаратах создавали непреодолимые препятствия на пути создания точной количественной денсито- и морфометрической модели биоматериала и/или патологии. Насколько нам известно, в настоящее время единственными широко применяющимися в медицинской практике методами морфометрии являются методы, реализованные в самих системах МАМ для технологических целей предварительной сортировки галерей типов объектов анализа. Относительный успех этих методов распознавания цитологических образов в МАМ связан, наряду с другими факторами, с применением весьма значительных обучающих выборок объектов морфометрии, сбор которых в составе цифровых моделей препаратов осуществляется рассмотренными средствами самих специализированных МАМ. Подобные представительные выборки практически недоступны за пределами технологий МАМ. Таким образом, технологии МАМ имеют значительный ресурс для улучшения качества автоматического обнаружения и сортировки морфологически сложных и редких типов объектов, со временем приближаясь к решению этой весьма сложной задачи на уровне зрительного анализатора опытного врача.
5. Технико-экономические характеристики МАМ
Автоматические анализаторы морфологии, не использующие оптическое разрешение, и МАМ являются конкурентами в небольшой области сортировки объектов на типы с простыми морфологическими признаками. В целом эти аналитические устройства не столько конкурируют, сколько контролируют и дополняют друг друга. Высокопроизводительные автоматические гемоанализаторы имеют высокую стоимость эксплуатации (расходные материалы, техническое обслуживание) что приемлемо в крупных лабораториях, но затрудняет применение в небольших лабораториях регионов с низкой плотностью населения. В этих же лабораториях обычны трудности с квалификацией персонала. Вместе с тем комплексы МАМ при сравнимой с автоматическими анализаторами цене имеют низкую стоимость эксплуатации (высокая надежность, практически не требующая обслуживания, дешевые расходные материалы, дешевые линии связи) и благодаря телемедицинской компоненте создают возможность высококачественного и контролируемого выполнения анализов при невысокой квалификации местного персонала. В небольшой лаборатории экономически выгодно применять недорогой гемоанализатор для определения концентраций клеток и МАМ для дифференциальной сортировки. Один и тот же комплекс МАМ может применяться для анализов разных биоматериалов, что дополнительно снижает себестоимость.
Во всех лабораториях экономические преимущества применения МАМ и МИМ по сравнению с ручной микроскопией связаны с разгрузкой высококвалифицированного персонала, с увеличением чувствительности и диагностической значимости, с контролем качества анализов.
В настоящее время комплекс МАМ может быть укомплектован в основном покупными аппаратными комплектующими, масштабное производство которых (автоматизированные микроскопы, загрузчики, видеокамеры, компьютеры) освоено всеми основными игроками рынка. Характеристики комплектующих благодаря высокой конкуренции стремительно улучшаются. Специализированные функции МАМ конкретных методик анализа, реализация которых требует интеграции идей на стыке многих областей знаний, связана главным образом с программным обеспечением, разрабатываемом сравнительно небольшим числом фирм. Такое разделение труда позволяет рассчитывать, что скорость и точность МАМ будут и дальше увеличиваться, стоимость будет снижаться благодаря внедрению новых аппаратных элементов и увеличению объема производства [16, 17].
По данным автора, Россия занимает одно из лидирующих мест в мире по применению МАМ, в значительной степени за счет поставок отечественных комплексов МАМ производства ЗАО "МЕКОС" [6]. Достигнутый уровень и перспективы улучшения характеристик позволяют рассчитывать на массовое внедрение МАМ анализаторов в ближайшем будущем.
Литература
1. Briggs C., Longair I., Slavik M., Thwaite K., Mills R., Thavaraja V., Foster A., Romanin D., Mashin S. Can automated blood film analysis replace the manual differential? An evaluation of the CellaVision DM96 automated image analysis system. Int. Jnl. Lab. Hem. 2009, 31, 48-60.
4. Tawfik OW, Kimler BF, Davis M, Donahue JK, Persons DL, Fan F, Hagemeister S, Thomas P, Connor C, Jewell W, Fabian CJ. Comparison of immunohistochemistry by automated cellular imaging system (ACIS) versus fluorescence in-situ hybridization in the evaluation of HER-2/neu expression in primary breast carcinoma. Histopathology. 2006 Feb;48(3):258-67.
5. Sarvary E, Lee D, Varadi, J, Varga M, Gaal I, Chmel R, Beko G, Kanyo Z, Nemes B, Gerlei ZS, Fazakas J, Kobori L, Herold ZS, Nemeth S, Galoczi I, Jaray J, Langer R. The iQ®200 Microscopic Analyzer is a valuable tool for evaluation of urinary sediment at transplanted patients. Interventional Medicine & Applied Science. Vol. 2(1) 22-26 2010.
8. Grabe N, Lahrmann B, Pommerencke T, von Knebel Doeberitz M, Reuschenbach M, Wentzensen. N. A virtual microscopy system to scan, evaluate and archive biomarker enhanced cervical cytology slides. Cell Oncol. 2010; 32(1-2):109-19.
9. Медовый В.С., Шмаров Д.А., Козинец Г.И. Значение автоматизированного микроскопического анализа для подсчета редко встречающихся клеток крови. Лаборатория, N1, 2013, стр. 61.
13. National Committee for Clinical Laboratory Standards (1992). Reference Leukocyte Differential Count and Evaluation of Instrumental Methods: Approved Standards. NCCLS H20-A Villanova, PA.
14. www.fsvok.ru
15. Медовый В.С., Пятницкий А.М., Соколинский Б.З., Маркеллов В.В., Федорова Д.С., Федоров И.В. Разработка и испытания автоматизированного комплекса микроскопии. Оптический журнал, 78,1, 2011, стр. 66-73.
16. Medovyi V.S., Pyatnitskii A.M., Robotic Microscopy and information technology to increase accuracy, sensitivity and availability of blood cell analyses. Current microscopy contributions to advances in science and technology (Microscopy Book Series, Publisher: Formatex Research Center), Book 5, Volume 1, p. 775-781, December 2012
17. В.С. Медовый, А.М. Пятницкий, Б.З. Соколинский. Инновационный проект "Разработка комплекса автоматизированной микроскопии, его облачного функционала, Интернет ресурса лабораторной телемедицины для медицинских анализов биоматериалов (МЕКОС-Ц3)". Инноватика и экспертиза, N2(9), январь 2013 г., стр. 50-64.
Гематология
